СЕЛЕН В НАНОФОРМЕ: ТОКСИЧНОСТЬ И БЕЗОПАСНОСТЬ

Введение

Сегодня нанотехнологии затрагивают практически все сферы деятельности, среди которых одно из приоритетных мест занимает медицина. Благодаря малому размеру, площади и модификации поверхности, а также поверхностному заряду, лучшей растворимости и своей многофункциональности наночастицы являются уникальными биологически активными объектами. Их применение позволяет решать многие биофармацевтические и фармакокинетические проблемы. Наночастицы повышают терапевтическую эффективность препаратов, улучшают водорастворимость соединений, позволяют целенаправленно доставлять лекарства [1, 2, 3, 4], обладают уникальными свойствами, не характерными для веществ, входящих в состав нанокомпозитов в ненаразмерном состоянии [5, 6].

Особое место занимают нанокомпозиты, содержащие эссенциальные вещества, которые входят в состав ферментных систем млекопитающих. Немаловажную роль среди них играет селен. Это незаменимый биологически активный микроэлемент, входит в состав селенопротеинов [7]. Так, в качестве селеноцистеина Se входит в состав антиоксидантных ферментов, таких как глутадионпероксидаза, тиоредоксиредуктаза и селенопротеин Р.  В этих ферментах Se действует как редокс-центр и необходим для поддержания биохимической активности ферментов. Также Se участвует в поддержании окислительно-восстановительного гомеостаза, воспалительных и иммунологических реакциях за счет  регуляции экспрессии воспалительных генов на эпигенетическом уровне [8], углеводном обмене,  проявляет высокую реактивность к окислителям [9, 10], влияет на репродуктивное здоровье, поддержание функции мозга при болезни Альцгеймера [11], а также обладает нейропротективными свойствами [12], противоопухолевой активностью, выступая в качестве индуктора апоптоза раковых клеток  [13, 14, 15], является высокоэффективным антиоксидантом пролонгированного действия в регенеративной медицине [16, 17, 18, 19, 20].

Дефицит Se связан с многочисленными заболеваниями человека  [21]. В то же время избыточное содержание Se может быть токсичным и приводить к селенозу.

За последние десятилетия проведено много исследований, которые позволили выявить значительный биомедицинский потенциал наночастиц селена. Однако наряду с благоприятными результатами очень важно изучить и негативное влияние, возможные побочные эффекты, связанные с использованием  наноселена.

Наночастицы способны проникать в организм человека ингаляционным, пероральным, парентеральным путями и взаимодействовать с внутриклеточными структурами и макромолекулами в течение длительного времени. Затем наночастицы могут распределяться в различные органы, где они способны оставаться в той же структуре или модифицироваться, метаболизироваться. К сожалению, на сегодняшний день не существует однозначной информации о том, являются ли наночастицы абсолютно безопасными для человека или обладают определенной токсичностью? Таким образом, изучение абсорбции, распределения, метаболизма и экскреции наночастиц, механизмы взаимодействия с живыми системами необходимо для понимания их активности, поведения в биологических системах и потенциальной опасности in vivo.

Формы существования селена

В природе селен существует преимущественно в виде селената (Se⁶⁺), селенита (Se⁴⁺), селенида (Se^2–) и элементарного селена (Se⁰), при этом последний нерастворим в водных средах, менее токсичен и биологически инертен. Однако было обнаружено, что в виде наноразмерных частиц элементарный селен является не только биосовместимым, но и обладает рядом биологических активностей (противоопухолевой, антимикробной, протекторной) [22, 23, 24, 25].

Токсичность селена в наноформе для млекопитающих

Подавляющее большинство исследований свидетельствует о том, что элементарный селен в виде наночастиц является для млекопитающих менее токсичным, чем неорганический или органический селен [26]. Так, например, из опытов, проведенных на мышах линии Kunming, были получены данные о том, что химически синтезированные наночастицы селена  в 7 раз менее токсичны, чем селенит (LD₅₀ составляла 113 и 15 мг Se на кг веса соответственно), и в 3,5 раза менее токсичны, чем селенометионин (LD₅₀ была 92,1 и 25,6 мг Se на кг веса соответственно) [27, 28, 29].

Известно, что в низких концентрациях наночастицы селена не оказывают никакого токсичного воздействия на организм животных (исследуемые параметры достоверно не отличаются от таковых в контрольной группе), высокие концентрации, выше 3 мг на кг веса животного, вызывают изменения, характерные для воздействия высокими дозами неорганического селена, хотя и менее выраженные [28, 30, 31, 32].

При изучении острой и субхронической токсичности наночастиц селена, покрытых полисахаридами и протеинами, выявлена низкая острая пероральная токсичность у мышей линии ICR и крыс линии Sprague-Dawley. Оценка субхронической токсичности продемонстрировала, что пероральная концентрация нанокомпозита, не вызывающая видимого эффекта, составляла менее 200 мкг Se на кг веса в день, что примерно в 30 раз превышает допустимый верхний уровень потребления Se в организме человека. Данный нанокомпозит не оказал значительного повреждения основных органов, включая печень, селезенку, сердце, почки и легкие [33].

Классическим симптомом токсичного воздействия селена на организм считается подавление роста, что наблюдается при воздействии высокими концентрациями наночастиц селена. Например, снижение массы тела животных продемонстрировано в эксперименте с крысами линии Sprague–Dawley при пероральном введении в течение двух недель наночастиц селена (размер наночастиц 80 нм), полученных путем восстановления селенита натрия аскорбиновой кислотой в присутствии хитозана, в концентрациях, превышающих 2 мг Se на кг массы тела. При этом введение животным наночастиц в концентрациях 0,2 и 0,4 мг Se на кг массы тела стимулировало их рост, а доза в 8 мг Se на кг веса подавляла рост животных уже после первой недели применения [34].

В эксперименте, проведенном на мышах линии Kunming, наночастицы селена, размером 20-60 нм, полученные химическим восстановлением селенита глутатионом, также подавляли рост животных в концентрации 4 и 6 мг Se на кг веса, хотя и менее эффективно, чем селенит. При этом внесение наночастиц селена в концентрации 6 мг Se на кг веса полностью подавляло рост в течение первых трех дней, после чего наблюдалось восстановление скорости роста [28].

Внесение в рацион крыс линии Sprague–Dawley на протяжении 13 недель  наночастиц селена, размером 20-60 нм в концентрации 4 и 5 ppm (parts per million) Se приводило к снижению массы тела у самцов с восьмой недели эксперимента, а у самок с шестой и пятой недель соответственно, хотя эффект был менее выражен, чем при воздействии селенитом или белком, обогащенным селеном [30]. Однако в работе указывается, что при проведении предварительного эксперимента, в процессе которого в течение 13 недель крысам вводили наночастицы селена в концентрации 6 ppm, аблюдалась гибель животных, при этом достоверных различий в уровне смертности при использовании наноселена, селенита или белка, обогащенного селеном, не наблюдалось [30].

Другие исследователи не обнаружили разницы между токсическим воздействием наночастиц Se или селенита натрия. Самкам крыс вводили перорально в течение 28 дней либо 0,05, 0,5 или 4 мг Se / кг массы тела/ день в виде наночастиц селена, размером 20 нм, либо 0,05 или 0,5 мг Se / кг массы тела / сутки в виде селенита натрия. Самцам крыс вводили 4 мг Se / кг массы тела в день в виде наночастиц селена. Установлено, что при высоких дозах наночастиц селена наблюдалась токсичность. При всех дозах при приеме наночастиц селена и при дозе селенита натрия 0,5 мг Se / кг массы тела в сутки наблюдалось снижение массы тела по сравнению с контролем. Относительная масса печени была увеличена при использовании Se в дозе 0,5 мг Se / кг массы тела в день как в виде наночастиц, так и в виде селенита натрия. При этом не обнаружено влияния на нейротрансмиттеры мозга или гематологические показатели по сравнению с контролем. Из полученных данных авторы делают вывод о том, что  селен в наноформе и ионный Se оказывают сходную токсичность [35].

Работа, проведенная на мышах мышах Swiss, которые в течение 14 дней получали наночастицы селена, диаметром 80-220 нм, синтезированные биологическим методом при использовании в качестве продуцента Bacillus sp. MSh-1, показала, что наночастицы в концентрации 20 мг Se на кг веса вызывали не только снижение массы тела, но и 20% гибель животных, тогда как внесение более низких концентраций не вызывало отставания в росте и не приводило к гибели. В данном эксперименте биогенные наночастицы селена проявляли токсичность в 26 раз меньшую по сравнению с диоксидом селена (LD₅₀ составляла 198.1 и 7.35 мг Se на кг веса соответственно) [31].

Другие исследователи отмечают, что даже высокие дозы селена в наноформе не подавляют рост и не вызывают повреждения печени и почек, а также изменения гематологических показателей у здоровых мышей [26].

Еще одним широко известным токсическим эффектом, проявляющимся в результате воздействия высоких концентраций селена, является реакция гепатотоксичности. Так, при пероральном введении наночастиц селена в течение двух недель в концентрации 8 мг Se на кг веса у крыс наблюдалось увеличение печени, а также гистопатологические изменения, такие как фокальный некроз и дегенерация гепатоцитов. Кроме того, в крови животных повышалась активность печеночных ферментов: аланиновой, аспарагиновой трансаминаз, щелочной фосфатазы, что также указывало на повреждение печени [34]. Подобным образом увеличение относительной массы печени и повышение активности аланиновой аминотрансферазы в крови у самцов и самок было продемонстрировано при длительном употреблении крысами наночастиц селена в концентрации 5 ppm, в то же время при воздействии концентрациями 4 и 5 ppm наблюдалась вакуольная дегенерация  гепатоцитов [30].

По другим данным при введении самкам крыс  перорально в течение 28 дней  0,05, 0,5 или 4 мг Se / кг массы тела/ день в виде наночастиц, размером 20 нм, не было отмечено никаких гистологических изменений в печени животных [35].

Помимо патологии печени в исследовании, проведенном с крысами линии Sprague–Dawley в течение 14 дней, были обнаружены изменения в других органах животных, свидетельствующие о различной степени увеличения почек, легких и селезенки, вызванной употреблением наночастиц селена в концентрации, превышающей 2 мг Se/кг массы тела, в то же время исследования сердца, тестикул и тимуса указывали на атрофию этих органов. Изменения в структуре органов были продемонстрированы на гистопатологических препаратах животных, получавших наночастицы селена в концентрации 8 мг Se/кг массы тела. Так, на препаратах почек были обнаружены признаки гломерулонефрита и некробиоза отдельных клеток почечных канальцев; на срезах легких наблюдались точечные кровоизлияния, сопровождающиеся заполнением интраальвеолярного и бронхиального просветов эритроцитами, а также утолщение эпителиальных перегородок. Корковая зона тимуса на гистологических препаратах крыс, получавших наночастицы селена в высоких концентрациях, была тоньше, чем в контрольных образцах, и граница между корковой зоной и медуллярной не была четкой, на препаратах тестикул были выделены атрофия семенных канальцев, нарушение сперматогенеза, а также повышенное число поврежденных семенных канальцев. Кроме того, TUNEL-окрашивание препаратов показало, что количество апоптотических клеток было выше в препаратах органов крыс, получавших наночастицы селена в концентрациях 4 и 8 мг селена на кг веса тела [34]. Увеличение массы селезенки, головного мозга и сердца также наблюдалось у самцов крыс, селезенки и сердца – у самок, получавших в течение 13 недель наночастицы селена в концентрации 5 ppm [30].

Помимо изменения активности печеночных ферментов, высокие концентрации наночастицы селена могут вызывать изменения  других биохимических показателей крови, например, повышение активности креатинфосфокиназы [31], повышение [31] или снижение [30] количества гемоглобина и эритроцитов, увеличение содержания общего билирубина, креатинина, мочевины, триглицеридов [31], холестерина [31, 34]. Также у животных наблюдалось повышение количества лейкоцитов, тромбоцитов, гемоглобина и гематокрита [31].

Под действием наночастиц селена могут изменяться показатели окислительного стресса (снижение количества малонового диальдегида и восстановленного глутатиона) и активность ферментов детоксикации в тканях (увеличение активности глутатион S-трансферазы в 2 раза по сравнению с контролем) [28],  уменьшение окисления липидов и белков, повышение глутатионпероксидазы, супероксиддисмутазы и каталазы [36] , что указывает на системные изменения, вызванные воздействием наночастиц селена.

При локальном введении в зону перелома нанокомпозита селена и арабиногалактана у кроликов методом термометрии установлено, что на 9–21-е сутки после операции отмечалось достоверное увеличение температурных показателей в области операционной раны по сравнению с контрольными величинами, что может быть проявлением активизации обменных процессов в зоне репарации в связи с наличием дополнительного источника селена [37, 38].  При этом в зоне травматического повреждения наблюдается низкая интенсивность минерализации формирующейся костной мозоли [39, 40].

Токсичность селена в наноформе для объектов биоценоза

Хотя селен в виде наночастиц в высоких концентрациях вызывает изменения, затрагивающие практически все функции организма, его воздействие на организм млекопитающих оказывается менее токсичным, чем при воздействии селена в виде неорганических или органических соединений.

У рыб, напротив, наблюдается совершенно иная реакция на воздействие соединениями селена. При сравнении токсичности наночастиц селена и селенита в отношении рыб видов Pangasius hypophthalmus и Oryzias latipes, было показано, что действие наночастиц является более агрессивным. Наночастицы, синтезированные биологическим методом при помощи экстракта Labeo rohita, активнее вызывали гибель Pangasius hypophthalmus в условиях эксперимента, и LC₅₀ через 96 часов воздействия для наночастиц составила 3,97 мг/л, тогда как для неорганического селена LC₅₀ была 5,82 мг/л [41].

В исследовании воздействия наночастицы селена, размером 20-60 нм, синтезированные путем восстановления селенита глутатионом, на Oryzias latipes было показано, что наночастицы вызывали 100% смертность в концентрации 3,2 мг Se на литр, тогда как селенит в концентрации 2 мг/л приводил только к 10% смертности, а в концентрации 8 мг/л – к 80% гибели рыб. При этом рассчитанное значение LC₅₀ по прошествии 48 часов для наночастиц составила 1,0 мг Se/л, а для селенита – 4,7 мг Se/л [42].

Оценка влияния химически синтезированных наночастиц селена разного размера (25-90 нм и 50-250 нм), полученных в результате восстановления селенита глутатионом, и биологически синтезированных наночастиц (100-350 нм) на эмбрионы рыб вида Danio rerio, показала более высокую токсичность химически синтезированных наночастиц селена. В работе было продемонстрировано, что через 72 часа после оплодотворения икринок наиболее высокая смертность наблюдалась при инкубации с химически синтезированными наночастицами, для которых даже при концентрации в 1 мг/л Se вызывал 56%-ную смертность, в то время как при воздействии селенита или биологически синтезированных наночастиц  гибель в этот период инкубации не наблюдалась  [43].

Токсичность химически и биологически синтезированных наночастиц для эмбрионов Danio rerio также оценивались по снижению скорости выхода эмбрионов из икринок, в данном случае химически синтезированные наночастицы с частицами меньшего размера показали наибольшую токсичность. Более того, скорость выхода замедлялась даже при низких концентрациях химически синтезированных наночастиц (от 0,2 мг/л) и через 72 часа после оплодотворения (период, когда в контроле наблюдался 100% выход из икринок) наблюдался выход только 75% эмбрионов, в то время как токсичное воздействие селенита, химически и биологически синтезированных наночастиц с частицами большего размера наблюдалось только при концентрациях выше 2 мг/л Se. С увеличением концентрации химически синтезированных наночастиц скорость выхода снижалась в большей степени, и только 25% эмбрионов покинули икринки на 72 часу при концентрации 5 мг Se /л. Снижение скорости выхода из икринок авторы связывают с возможным ингибированием наночастицами селена инкубационного фермента хорионазы [43].

Помимо непосредственного влияния на жизнеспособность рыб наночастицы селена оказывают воздействие на функционирование органов и систем. Так, у Oryziaslatipes после 10 дней инкубации с наночастицами в концентрации 100 мкг Se/л наблюдалось гипернакопление селена в печени, которое было в шесть раз выше, чем при инкубации с селенитом в соответствующей концентрации. Кроме того, наночастицы также вызывали более эффективное накопление селена в жабрах и мышцах по сравнению с селенитом, причем различия варьировали от двух до четырех раз. При изучении выведения селена из организма рыб (после 10 дней воздействия селенитом и наночастицами селена их на 7 суток помещали в воду, не содержащую селен) концентрация селена в мышцах несколько снижалась (42,5% для селенита и 36,5% для наночастиц), тогда как в печени и жабрах его концентрация существенно не изменялась [43].

В экспериментах по элиминации скорость клиренса селена в течение 7 дней составляла 2,34 мкг Se/(кг ч) для селенита и 8,7 мкг Se/(кг ч) для наночастиц, что авторы связывают с более слабым включением наночастиц селена в состав селенопротеинов. Однако, несмотря на более высокую скорость клиренса, наночастицы обеспечивали активную аккумуляцию селена в печени и в жабрах рыб, в связи с чем концентрация селена в этих органах оставалась после 7 дней элиминации по-прежнему высокой [43].

         Гипераккумуляция селена наблюдалась также в печени, жабрах и ткани мозга в эксперименте с рыбами вида Pangasius hypophthalmus при воздействии наночастиц в концентрациях от 2,5-4,0 мг Se/л, подобный эффект был продемонстрирован и при инкубации с неорганическим селеном, однако только при более высоких его концентрациях (от 4,5 до 6,0 мг/л). В то же время в данном исследовании в мышцах наночастицы накапливались в меньшей степени, чем неорганический Se, и активно выводились из организма. В печени Pangasius hypophthalmus после воздействия наночастиц и неорганического Se при гистопатологическом анализе был обнаружен ряд морфологических изменений, таких как зернистая дистрофия, очаговый некроз, интерстициальный отек, кровоизлияние, гипертрофия гепатоцитов, наличие пикнотических ядер и крупных вакуолей. В жабрах также наблюдались изменения, такие как утолщение эпителия первичных пластинок, скручивание вторичных, гиперплазия эпителия и слияние вторичных пластинок [41].

         Кроме того, в исследовании воздействия селена в форме наночастиц на организм рыб Pangasius hypophthalmus [41] было продемонстрировано, что наночастицы влияют на антиоксидантную систему (активность каталазы повышалась на 244-514%, тогда как активность супероксиддисмутазы ингибировалась в печени, жабрах и ткани головного мозга), систему детоксикации (активность глутатион S-трансферазы возрастала на 153-374% в печени, жабрах и ткани головного мозга), а также на активность ферментов, связанных с повреждением печени и тканей (активность аланиновой и аспарагиновой трансаминаз повышалась в мышцах, печени, жабрах и в ткани мозга на 181-689% и на 94-315% соответственно). При этом активность ферментов повышалась или ингибировалась при воздействии как низкими концентрациями наночастиц, так и высокими (от 2,5 до 4,0 мг/ л).

Подобное ингибирование активности супероксиддисмутазы наблюдалось также в печени Oryzias latipes, при этом наночастицы проявляли более мощные ингибирующие свойства, чем селенит, и увеличивали концентрацию в печени глутатион S-трансферазы, в то время как селенит не оказывал никакого видимого влияния [43].

Заключение

Из приведенных данных можно сделать выводы о том, что элементарный селен в форме наночастиц может влиять на иммунорегуляцию, репродуктивную функцию, работу почек и в большей степени печени, модулировать активность антиоксидантной системы и системы детоксикации, а также в высоких концентрациях (выше 2 мг Se на кг веса животного) вызывать развитие селен-индуцированной токсичности как у млекопитающих, так и у рыб. При этом для последних было показано, что наночастицы селена являются более токсичными, чем неорганический селен, и вызывают более острую реакцию организма на воздействие даже низкими концентрациями, возможно связанную с гипераккумуляцией селена в тканях, что еще раз напоминает о необходимости учета проблем экотоксичности нанокомпозитов селена [44].