ВАЛИДАЦИЯ ПЦР-ТЕСТА В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ОДНОНУКЛЕОТИДНОГО ПОЛИМОРФИЗМА RS1495741 В ГЕНЕ ЧЕЛОВЕКА NAT2, СВЯЗАННОГО С АЦЕТИЛИРОВАНИЕМ КСЕНОБИОТИКОВ

Актуальность

Ариламин-N-ацетилтрансфераза-2 (NAT2) является ферментом второй фазы биотрансформации ксенобиотиков, который осуществляет ацетилирование ароматических и гетероциклических аминов. Ген фермента локализован на восьмой хромосоме и имеет ряд вариабельных локусов, ассоциированных с медленным или быстрым ацетилированием субстрата [1]. Сочетание нуклеотидов в виде однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) в гене NAT2 используется для генетического тестирования и отнесения людей к категории быстрых или медленных ацетиляторов. Люди – медленные ацетиляторы, имеют более высокие риски развития побочных эффектов при применении лекарственных препаратов, содержащих производные аммиака: изониазид, прокаинамид, гидралазин, сульфаниламиды, нитразепам, призидилол, амринон, клоназепам, кофеин, пищевые канцерогены и др. Определение генотипа NAT2 позволяет назначать лекарственные средства c учетом ожидаемой фармакокинетики, что является основной задачей перехода к предиктивной персонализированной медицины [2].

Распределение людей по типу ацетилирования ксенобиотиков имеет существенные отличия в различных этнических популяциях: быстрый тип ацетилирования наиболее характерен для монголоидной расы, медленный чаще встречается в популяциях европеоидов [3,4,5].

Начиная с 1952 года известно о высокой частоте возникновения нейро- и гепатотоксических эффектов при применении противотуберкулезного препарата изониазида в группах пациентов с медленной скоростью ацетилирования субстрата по сравнению с быстрыми ацетиляторами [6,7].

Дальнейшие фармакокинетические исследования показали, что концентрация токсичного метаболита изониазида – гидразина в сыворотке крови значительно выше у медленных ацетиляторов, чем у быстрых [8]. В работе R.Verma (2021) показано, что назначение препарата в меньшей дозировке позволяет снизить риски развития изониазид-индуцированного поражения печени у медленных ацетиляторов при сохранении эффективной концентрации препарата в крови [9].

В связи с этим в современных клинических рекомендациях по лекарственным поражениям печени обращается внимание на важность определения у больных генетически детерминированного типа инактивации препаратов, в ряду которых изониазид по частоте токсического эффекта стоит в первой пятерке [10,11,12].

Известно несколько методов полимеразной цепной реакции (ПЦР) генотипирования гена NAT2, основанных на определении шести ОНП, секвенировании второго экзона с последующим определением генотипа с использованием специального алгоритма, анализе длины рестрикционных фрагментов ДНК и способ определения полиморфизма гена NAT2 (rs1801280) в комбинации с генами других ферментов биотрансформации с помощью метода гибридизации на биологическом чипе [9,13,14]. Существующие способы отличаются трудоемкостью и высокой стоимостью, из-за которых они не применимы в практическом здравоохранении и используются только для научных исследований.

Нами предложен метод определения генотипа, связанного с ацетилированием ксенобиотиков у человека, построенный на идентификации нового полиморфизма гена NAT2 rs1495741 с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) [15] на основе разработанной генно-инженерной конструкции, представляющей собой положительный контроль. Разработка полнофункционального опытного образца и клинико-лабораторные испытания разработанного медицинского изделия позволит использовать его в практическом здравоохранении. В соответствии с требованиями ГОСТ Р ЕН 13612—2010 «Оценка функциональных характеристик медицинских изделий для диагностики in vitro» необходимо провести процедуру оценки применимости (валидации) разрабатываемого набора ПЦР [16]. 

Цель исследования: конструирование и сравнительная оценка применимости разработанного авторами набора реагентов для определения полиморфизма в гене человека NAT2 методом ПЦР в режиме реального времени для оценки типа ацетилирования ксенобиотиков у человека. 

Материалы и методы

Испытания проводили на базе Научно-исследовательского института Биомедицинских исследований Иркутского государственного медицинского университета и института эпидемиологии и микробиологии Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека. Конструирование набора ПЦР осуществляли в соответствии с описанием патента на изобретение RU 2756203 от 28.09.2021 [15]. Конструирование праймеров и зондов осуществляли в ручном режиме исходя из структуры описания SNP rs1495741 в референсных геномах (в диапазоне 200 нуклеотидных последовательностей справа и слева от позиции мишени) [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs1495741]. Положительные контроли разрабатывались на основе кольцевой плазмиды pJet1.2/blunt, содержащей ген NAT2 с аллелями rs149741A и rs1495741G.

 Проверку практической применимости разработанного набора реагентов осуществляли в сравнении с коммерческим набором реагентов для выявления полиморфизмов C282T, T341C, C481T, G590A, A803G, G857A в гене человека NAT2 методом ПЦР в режиме реального времени для применения в научно-исследовательских целях, производства ООО НОМОТЕК, Россия (ГенТест-М NAT2). Амплификацию проводили на амплификаторе CFX БиоРад в соответствии с инструкцией производителя. 

Для оценки валидации осуществляли опыты по определению аналитической чувствительности (АЧ), диагностической чувствительности (ДЧ), диагностической специфичности (ДС), прецизионности (П) и воспроизводимости (В).

В качестве материала для исследования использовали ДНК, выделенную из клеток щечного эпителия, взятых у 37 добровольцев, в том числе 18 мужчин и 19 женщин. Информированное согласие было получено от каждого участника исследования. Проведение исследования было одобрено локальным этическим комитетом Иркутского государственного медицинского университета (протокол № 4 от 10.11.2025).

Мазок с внутренней поверхности щеки человека (буккальный соскоб) брали сухим стерильным одноразовым зондом с ватным тампоном с внутренней поверхности обеих щек вращательными движениями зонда.

Суммарную фракцию нуклеиновых кислот из исследуемого материала сорбционным методом с помощью набора для выделения геномной ДНК из клеток, тканей и крови по протоколу производителя (ООО «Биолабмикс», Россия). Приготавливали 20-кратную смесь праймеров, таким образом, чтобы конечные концентрации в растворе 1495741F и 1495741R составили по 6 μМ, а 1495741G и 1495741A по 3 μМ, соответственно (табл. 1).

Таблица 1. Праймеры и зонды, используемые в работе

Table 1. Primers and zonds used in the work

Далее отбирали аликвоты по 15 мкл и помещали в амплификатор CFX96 Touch (БиоРад). По каналу Fam наблюдали вариант «rs1495741A», по каналу Hex - «rs1495741G».

Результаты генотипирования с использованием разработанного набора реагентов сопоставляли с набором ГенТест - М NAT2 в качестве референс-теста. Исходя из практической значимости медленные ацетиляторы выделялись в отдельную группу, а промежуточные и быстрые формировали группу людей с быстрым типом ацетилирования ксенобиотиков [17]. В калькуляторе производителя набора NAT2 Calculator часть генотипов не определялась на как «быстрые ацетиляторы» ни как «медленные ацетиляторы». При этом результаты «быстрые ацетиляторы» набора NAT2 Calculator считались по умолчанию таковыми, если они не были определены как «медленные ацетиляторы» этим же тестом.

Расчёт специфичности и чувствительности как статистического показателя, отражающего долю положительных результатов, которые правильно идентифицированы, проводили в соответствии с методикой [18].

Для оценки чувствительности и специфичности разработанных тестов использовались следующие критерии.

где ИП – количество истинно-положительных результатов, ЛО – количество ложноотрицательных результатов.

где ИО – количество истинно-отрицательных результатов, ЛП – количество ложноположительных результатов.

Доверительный интервал рассчитывали по методу Вилсона.

Количество истинно-положительных определяли набором ГенТест-М NAT2 компании Евроген (https://evrogen.ru/products/nomotech/NAT2?ysclid=mdh5f5va13776200400)

в соответствии с протоколом производителя по калькулятору NAT2 Calculator http://shtest.evrogen.net/NAT2/ (Евроген). Количество истинно-отрицательных результатов определяли аналогичным образом. Ложноположительными и ложноотрицательными результатами (сомнительные, табл.2) считали при несовпадении результатов между разрабатываемым тестом и референс-тестом от компании Евроген.

Воспроизводимость набора определяли на 37 пробах, тестирование которых проводили в двух независимых лабораториях (Научно-исследовательского института Биомедицинских исследований Иркутского государственного медицинского университета и института эпидемиологии и микробиологии Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека) разными аналитиками на разном оборудовании, в разные дни, с использованием разных партий реагентов. На основании полученных данных рассчитывали частоту расхождений результатов генотипирования в %. 

Для определения прецизионности проводили 3-х кратное тестирование 10 параллельных анализов одним оператором в одной и той же лаборатории с использованием одной партии реактивов, одного и того же оборудования в пределах временного промежутка в три рабочих дня. Хронометраж времени на одно исследование проводили путем 3-х кратного измерения на одной и той же пробе обоими методами.

Обработка данных выполнялась с помощью языка программирования python 3.12.11.

Результаты

На первом этапе сконструированы позитивные контроли «rs1495741G» и «rs1495741A» на основе молекулярного клонирования в плазмиду pJET1.2/blunt согласно протоколу производителя (набора CloneJET PCR Cloning Kit, Thermo scientific). Работоспособность полученных контролей была проверена по характеру специфического связывания: связывание с контрольным образцом характеризовался классической S-образной формой кривых, в то время как неспецифичное связывание характеризуется либо худшей эффективностью реакции, либо ее полным отсутствием.

Оценка аналитической чувствительности проводилась путем постановки ПЦР с серийно разведенной ДНК. По результатам амплификации чувствительность праймеров и TaqMan зондов показала способность выявлять генотип rs1495741 NAT2 в количестве 0,1 нг/мкл на одну реакцию.

Результаты применимости диагностического набора в части раздельного определения генотипов NAT2 представлена в таблице 2.

Таблица 2. Показатели валидации ПЦР-теста в режиме реального времени для выявления однонуклеотидного полиморфизма rs1495741 в гене человека NAT2

Table 2. Validation parameters of a real-time PCR assay for the detection of the rs1495741 single nucleotide polymorphism in the human NAT2 gene

Обсуждение

В гене NAT2 идентифицировано несколько десятков вариабельных сайтов, локализованных как в зоне экзонов, так и в некодируемой области гена [13]. Как правило для оценки активности ацетилтрансферазы-2 используют 5-7 ОНП, расположенных во втором экзоне. Диагностические наборы, основанные на этих ОНП, в настоящее время используются только в научно-исследовательских целях в связи с трудоемкостью выполнения анализа, его высокой стоимостью и отсутствия единого подхода к трактовке результата. В отличие от этого, разрабатываемый набор реагентов для ПЦР-РВ для определения типа ацетилирования ксенобиотиков у человека основан на одном ключевом ОНП, находящемся в локусе rs1495741. Этот ОНП изначально был обнаружен при популяционном исследовании рака мочевого пузыря [3]. В процессе исследования на гепатоцитах и использовании классического генетического метода на 7 ОНП было показано, что ОНП rs1495741 имеет сильную коррелятивную связь с известным делением человеческой популяции на «быстрых» и «медленных» метаболизеров соединений ариламинов и гидразинов, в том числе изониазида [19]. Проведенные нами исследования на популяциях народов, проживающих в Восточной Сибири, Якутии и Монголии показали функциональную значимость ОНП rs1495741 для широкого круга национальностей [5,20]. Полученные результаты позволили приступить к конструированию компонентов диагностического набора для ПЦР-РВ. Дизайн праймеров и TaqMan зондов для ПЦР осуществлен авторами самостоятельно с использованием сервиса Oligo Tools https://geneglobe.qiagen.com/us/tools.

Для создания полноценного набора было необходимо разработать адекватные контроли и провести валидацию метода. Проведенные исследования показали применимость набора, высокую специфичность и чувствительность в сравнении с референтными методами. Ранее высокая диагностическая чувствительность разрабатываемого метода была подтверждена в сравнении с «золотым стандартом» - секвенированием по Сэнгеру [15]. Представленная в данной работе сопоставление с референтным набором для ПЦР ГенТест-М NAT2» показало сопоставимые результаты: специфичность - 1, чувствительность - 0,94. Главным достоинством является сокращение времени для проведения анализа в 1,25 раза и снижение себестоимости набора в 6,9 раза. Коммерциализация набора во многом будет определяться потребностью практических учреждений здравоохранения и значением анализа для определения лечебной тактики у конкретного больного. Во всех имеющихся клинических рекомендациях по лекарственным поражениям печени есть общие ссылки на важность учета врожденных факторов риска, к каковым относится и NAT2. В обновленной версии китайских клинических рекомендациях по лекарственно-индуцированному поражению печени, вызванному противотуберкулезными препаратами необходимость выделения группы медленных ацетиляторов приводится в двух пунктах: рекомендация № 1 (оценка риска) и № 15 (дозирование изониазида) [21]. В российских рекомендациях определение генетических маркеров рассматриваются как необходимый тест для прогнозирования идиосинкразии [12]. Очевидно, что наличие надежного и доступного для клинической практики инструмента определения принадлежности человека к медленным ацетиляторам станет важным шагом к персонализированному лечению и профилактике лекарственных поражений печени [22]. За этим стоит сокращение сроков временной нетрудоспособности, снижение стоимости лечения, профилактика формирования резистентных штаммов патогенов.

Заключение

Сравнительный анализ разработанной генно-инженерной конструкции в виде набора реагентов для определения полиморфизма в гене человека NAT2 методом ПЦР-РВ с целью оценки типа ацетилирования ксенобиотиков у человека показал его применимость для использования в лабораторной практике.  Предлагаемый способ отличается тем, что генотипирование гена ариламин-N-ацетилтрансферазы осуществляют путем детекции tag SNP rs1495741 c использованием специфических праймеров и двух флюоресцентно-меченных зондов, содержащих участки «замкнутых нуклеотидов». Сконструированные праймеры, ДНК-зонды, положительные контроли позволяют быстро, с высокой чувствительностью и специфичностью определить генотип NAT2 и соответствующий тип ацетилирования. Результаты внутри- и межлабораторных испытаний подтвердили, что лабораторный образец набора ПЦР-РВ для определения вариабельного сайта rs1495741 в гене человека NAT2, связанного с ацетилированием ксенобиотиков применим для проведения тестов при выполнении генетических исследований у людей.