д.м.н., профессор, главный научный сотрудник Научно-исследовательского института Биомедицинских технологий
Dr. Sci. (Med.), Professor, Chief Researcher of the Research Institute of Biomedical Technologies
д.м.н., директор Института эпидемиологии и микробиологии
Dr. Sci. (Med.), Director of the Institute Epidemiology and Microbiology
старший преподаватель кафедры медицинской биологии
Senior Lecturer at the Department of Medical Biology
к.м.н., старший научный сотрудник Научно-исследовательского института Биомедицинских технологий
Cand. Sci. (Med), Senior Researcher at the Research Institute of Biomedical Technologies
д.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории эпидемиологии и социально-значимых инфекций Института эпидемиологии и микробиологии
Dr. Sci. (Med.), Lieder Researcher of the Laboratory of Epidemic and Social Infections, Institute Epidemiology and Microbiology
к.б.н., научный сотрудник лаборатории эпидемиологии и социально-значимых инфекций Института эпидемиологии и микробиологии
Cand. Sci. (Biol.), Researcher of the Laboratory of Epidemic and Social Infections, Institute Epidemiology and Microbiology
д.м.н., доцент, проректор по научной работе, профессор кафедры инфекционных болезней
Dr. Sci. (Med.), Associate Professor, Vice-Rector for Research, Professor of the Department of Infectious Diseases
Актуальность. Полиморфизмы гена N-ацетилтрансферазы 2 определяют два основных типа ацетилирования ксенобиотиков: быстрое и медленное ацетилирование. В зависимости от скорости метаболизма изменяется частота развития побочных эффектов лекарственных препаратов. В частности, медленные ацетиляторы имеют более высокие риски развития нейро- и гепатотоксических поражений, связанных с приемом противотуберкулезного препарата - изониазида.
Цель исследования: Конструирование и сравнительная оценка применимости разработанного авторами набора реагентов для определения полиморфизма в гене человека N-ацетилтрансферазы 2 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с целью оценки типа ацетилирования ксенобиотиков у человека.
Материалы и методы. На основании евразийского патента на изобретение № 042541 осуществлено конструирование лабораторного образца медицинского диагностического изделия – набора реагентов, включающего смесь для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, праймеры прямой и обратный, специфические для гена N-ацетилтрансферазы 2, зонды для детекции полиморфизма rs1495741, содержащие красители FAM и R6G на 5'-конце, гасители BHQ2 RTQ1, замкнутые нуклеотиды. Произведено молекулярно-генетическое конструирование положительных контролей в виде кольцевой плазмиды pJet1.2/blunt, содержащей фрагмент гена N-ацетилтрансферазы 2 с аллелями rs149741A и rs1495741G. С использованием разработанного набора произведено исследование 37 проб дезоксирибонуклеиновой кислоты, полученных от практически здоровых людей в сравнении с известным аналогом. Для оценки применимости (валидации) осуществлено определение аналитической чувствительности, диагностической чувствительности, диагностической специфичности, прецизионности и воспроизводимости.
Результаты. Произведена валидация набора реагентов для полимеразной цепной реакции в режиме реального времени на определение типа ацетилирования ксенобиотиков у человека. Аналитическая чувствительность теста составила 0,1 нг/мкл дезоксирибонуклеиновой кислоты, диагностическая чувствительность - 0,94, диагностическая специфичность - 1. Другие показатели валидации методики удовлетворяют критерию приемлемости, что подтверждается соответствием установленному уровню внутрилабораторной прецизионности и межлабораторной воспроизводимости.
Заключение. В сравнении с референтным методом предложенный способ отличается меньшей трудоемкостью, экономией времени проведения анализа, меньшей стоимостью, сопоставимой чувствительностью и специфичностью. На основании результатов испытаний лабораторный образец набора полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для определения вариабельного сайта rs1495741 в гене человека N-ацетилтрансферазы 2, связанного с ацетилированием ксенобиотиков может быть рекомендован для проведения тестов при выполнении генетических исследований у людей.
Relevance. According to polymorphisms in the N-acetyltransferase 2 gene, two main acetylation types are distinguished: rapid and slow. The frequency of adverse drug reactions varies depending on the rate of metabolism. In particular, the incidence of neuro- and hepatotoxic effects of isoniazid is associated with genotype, with slow acetylators having a higher risk of adverse reactions.
Aim: To design and compare a reagent kit developed by the authors for detecting polymorphisms in the human N-acetyltransferase 2 gene using real-time Polymerase chain reaction, aimed at determining the type of xenobiotic acetylation in humans.
Materials and Methods. Based on Eurasian Patent No. 042541, a laboratory prototype of a medical diagnostic reagent kit was developed. The kit included a real-time Polymerase chain reaction mixture, forward and reverse primers specific to the N-acetyltransferase 2 gene, and probes for detecting the rs1495741 polymorphism labeled with FAM and R6G fluorophores at the 5'-end and BHQ2 RTQ1 quenchers with closed nucleotides. Positive controls were constructed as circular plasmids pJet1.2/blunt containing the N-acetyltransferase 2 gene with rs1495741A and rs1495741G alleles. Using the developed kit, 37 Deoxyribonucleic acid samples obtained from healthy individuals were analyzed and compared with the reference method. Analytical sensitivity, diagnostic sensitivity, diagnostic specificity, precision, and reproducibility were assessed to validate the method.
Results. Validation of the reagent kit for real-time Polymerase chain reaction determination of the xenobiotic acetylation type in humans was performed. The analytical sensitivity of the test, determined by titration of the positive control, was 0.1 ng/µL Deoxyribonucleic acid; diagnostic sensitivity was 0.94, and diagnostic specificity was 1. Other validation parameters met the established acceptability criteria, confirming adequate intra-laboratory precision and inter-laboratory reproducibility.
Conclusion. Compared with the reference method, the proposed approach is less labor-intensive, time-saving, and more cost-effective, while maintaining comparable sensitivity and specificity. Based on the validation results, the laboratory prototype of the real-time Polymerase chain reaction kit for detecting the rs1495741 polymorphic site in the human N-acetyltransferase 2 gene associated with xenobiotic acetylation can be recommended for use in human genetic studies.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.