АНТИОКСИДАНТЫ КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ БИОМАРКЕРЫ СТАДИЙ НЕАЛКОГОЛЬНОЙ ЖИРОВОЙ БОЛЕЗНИ ПЕЧЕНИ

Введение

Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) – заболевание, которое  характеризуется наличием значительного количества липидов (более 5%) в  гепатоцитах. НАЖБП представляет собой сложную проблему для гепатологов. Одним из критериев диагностики НАЖБП является отсутствие чрезмерного употребления алкоголя. Уровень потребления этанола 20 г в день и менее (или 140 г в неделю) одобрен в качестве приемлемого порога для определения НАЖБП [1].

НАЖБП - это общее понятие, которое включает в себя простой стеатоз печени, неалкогольный стеатогепатит (НАСГ) и цирроз печени, ассоциированный с НАСГ.

Простой стеатоз – это доброкачественное состояние, при котором отсутствует воспаление, нет прогрессирования патологического процесса в печени, но, согласно последним исследованиям, стеатоз является самостоятельным фактором риска развития сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) и их осложнений, а также НАСГ и фиброза печени [2,3].

НАСГ – это состояние гепатоцитов, которое, помимо стеатоза, характеризуется лобулярным воспалением, баллонной дегенерацией и фиброзом с риском прогрессирования в цирроз печени (ЦП) и развития гепатоцеллюлярного рака (ГЦР) [1]. Дифференциальная диагностика между простым стеатозом и НАСГ на ранних стадиях имеет важное значение из-за вероятности быстрого прогрессирования НАЖБП до ГЦР. В случае диагностики заболевания на ранних этапах можно предотвратить его прогрессирование, применяя такие простые подходы, как назначение средиземноморской диеты и повышение физической активности и [4].

В последние годы выявлена патогенетическая связь с окислительным стрессом (ОС) в отношении более чем 60 заболеваний [5]. Патологические состояния, такие как инфекционные процессы, воспаления различного генеза, эндотелиальная дисфункция, синдромом ишемии-реперфузии, а также сахарный диабет и онкологическая патология сопровождаются значительным образованием свободных радикалов. Прооксидантными факторами также являются алкоголь, токсины, ряд лекарственных препаратов, курение, ионизирующее излучение и образ жизни человека: избыточный вес, возраст, нерациональное питание, гиподинамия, стрессы.[5].

Печень является детоксикационной «лабораторией» организма, а также метаболически активным органом, основным местом синтеза белков, липопротеинов и других важных молекул. Ряд патологических состояний в печени сопровождается усилением окислительно-восстановительных реакций. При активации перекисного окисления липидов (ПОЛ) повреждаются мембраны гепатоцитов, их гибель запускает воспалительную реакцию, создает предпосылки для активации фиброгенеза. При повреждении ДНК продуктами ПОЛ, свободными радикалами могут возникать мутации, запускающие процессы канцерогенеза [6]. Таким образом, антиоксиданты (АО) и ОС играют ведущую роль в патогенезе НАЖБП и ускоряет развитие НАСГ[7].

 Биопсия печени остается лучшим диагностическим исследованием для подтверждения НАСГ, а также наиболее чувствительным и специфичным

способом получения важной прогностической информации при НАЖБП. Но данный метод является инвазивным и дорогостоящим, имеет ряд существенных ограничений, такие как отказ пациентов от исследования из-за возможных болевых ощущений, риска тяжелых осложнений, возможности ошибки при взятии пробы, биопсия неповрежденного участка при заборе пробы [8], ввиду этого требуется разработка новых стандартов диагностики.  Ряд маркеров ОС и АО используется для оценки прогрессирования заболевания и патологического состояния. В этой статье рассмотрены ключевые биомаркеры АО, которые были определены на клиническом и экспериментальном уровнях по данным литературы при НАЖБП.

Виды антиоксидантов

Окислительный стресс (ОС) – это значительное  усиление окислительных процессов в организме из-за недостаточного функционирования антиоксидантной системы (АОС) [9]. До настоящего момента нет единой классификации систем антиоксидантной защиты клеток. Систему защиты тканей и клеток от токсических метаболитов активных форм кислорода и продуктов ПОЛ условно разделяют на физиологическую и биологическую. Физиологическая защита включает механизмы, осуществляющие регуляцию доставки кислорода в клетки. Биологическая защита - это антиоксидантная система организма, разнообразные химические соединения, которые снижают активность радикальных процессов (рис. 1).

Рис. 1. Уровни защиты клеток макроорганизма от активных форм кислорода [39]

АО оказывают свое влияние на разных стадиях ПОЛ. Некоторые АО (например витамин Е) ингибируют начальную стадию процесса ПОЛ (отделение аллильного атома водорода от α-метиленового углеродного атома). Другие АО (витамины E и C) останавливают образование гидропероксидов, то есть предотвращают цепную реакцию ПОЛ. Кроме того, АО расщепляют образующиеся гидропероксиды, без образования радикалов (например, глутатион в сочетании с глутатионпероксидазой), действуют как вещества, формирующие хелаты с металлами (D-пенициллами). АО удаляют свободные радикалы, обладают нейтрализующей активностью [10,11]. Некоторые АО могут ингибировать инициацию процесса, разрушать гидропероксиды, прекращать цепную реакцию, а также обладать нейтрализующим действием, т.е. АО могут действовать практически на все фазы ПОЛ.

Образование недоокисленных продуктов метаболизма и свободных радикалов в норме происходит во время биохимических реакций организма непрерывно. Антиоксидантные ферменты нейтрализуют молекулы с высоким окислительным потенциалом, тем самым поддерживают баланс ПОЛ:АОС. Повышенное количество активных форм кислорода (АФК) при НАЖБП может непосредственно истощать антиоксидантные молекулы и ингибировать антиоксидантные ферменты. Система глутатиона является основным защитником организма от значительного увеличения свободных радикалов и механизмом подавления ПОЛ. Система глутатиона  включает в себя глутатион и ферменты его метаболизма: глутатионпероксидазу (ГПО), каталазу (КАТ), глутатионтрансферазу (ГТ), глутатионредуктазу (ГР), [12] (основные ферментные антиоксиданты).

Глутатион – трипептид, состоящий из аминокислот глутамина, цистеина, глицина, содержится в каждой клетке организма. Ферменты метаболизма глутатиона обеспечивают детоксикацию в органеллах клеток [13]. Глутатион является низкомолекулярной АС и может участвовать в неферментативной антиоксидантной защите, выступая эффективным сквэнджером («ловушкой») свободных радикалов [14].

Система глутатиона в организме восстанавливает более 300 окисленных субстанций, восстанавливает перекиси, выводит из организма продукты перекисного окисления фосфолипидов мембран, липидов, белков, нуклеиновых кислот в виде нетоксичных конъюгатов [14]. В клетках организма глутатион содержится преимущественно в восстановленной форме (GSH), причем отношение восстановленной (активной) формы к окисленной (неактивной) форме (GSSG) является маркером антиоксидантной защиты организма и оценки поддержания клеточного окислительно-восстановительного потенциала (в норме GSH/GSSG=10/1) [15]. GSH вырабатывается в печени и поддерживается в высокой концентрации в большинстве тканей. Восстановленная форма глутатиона регулирует клеточный окислительно-зависимый сигналинг и активность транскрипционных факторов. Кроме того, GSH являясь внутриклеточным антиоксидантом, играет роль «ловушки» свободных радикалов, косубстрата в реакциях детоксикации пероксидов, катализируемых ГПО и ГТ [16]. Снижение уровня восстановленного и окисленного глутатиона   ниже показателей нормы может быть маркером нарушения клеточного окислительного статуса [17].

ГТ является важным препятствием для развития деструктивного эффекта окислительного стресса. ГТ обладает высокой антиоксидантной активностью по отношению к продуктам ПОЛ ДНК, способна активировать транскрипцию генов [18,19].

В процессе образования активных форм кислорода, супероксиддисмутаза (СОД) катализирует расщепление супероксидного радикала до перекиси водорода. Образующаяся перекись водорода обезвреживается под действием КАТ или ГПО с помощью GSH [20].

К главным компонентам неферментативной антиоксидантной системы (АОС) относят низкомолекулярные вещества, которые обладают высокой способностью и скоростью взаимодействия с АФК. Роль низкомолекулярных АО тем более важна в случаях окислительного стресса, при котором составляющие ферментативной системы оказываются слабо действенными, вследствие быстрой инактивации ферментных антиоксидантов под действием свободных радикалов [21, 22,23,24,25,26,27].

Аскорбиновая кислота (витамин С), водорастворимый антиоксидант, способный уничтожать практически все физиологически значимые свободные радикалы, кроме того, является наиболее мощным внутри- и внеклеточным антиоксидантом. Он уничтожает супероксидные, гидроксильные и пероксильные радикалы, а также инактивирует гипохлорит и синглетный кислород [24,28].

Витамин Е (α-токоферол) является основным липофильным антиоксидантом в организме; сообщалось, что его уровень снижается при хронических заболеваниях печени различного происхождения. Он действует путем разрыва цепей, возникающих во время перекисного окисления полиненасыщенных жирных кислот. Витамин Е разрушает пероксильные радикалы, образующиеся при ПОЛ, образуя токофероксильный радикал [31,32,33,34].

Типы антиоксидантов по ферментной активности представлены в таблице 1.

Таблица 1. Физиологически важные антиоксиданты и их функции [29,30]

Оценка ферментных и неферментных антиоксидантов при НАЖБП

Состояние антиоксидантной системы у больных с НАЖБП оценивали согласно данным литературы [19,21] по концентрации ферментных антиоксидантов: сульфгидрильных SH-групп, активности СОД, глутатионпероксидазы и каталазы в сыворотке крови. При попадании остальных ферментных АО и белков в кровь, они инактивируются в течение 5-10 минут под действием протеаз крови или выводятся в неизменном виде почками. Соответственно большая часть ферментных антиоксидантов не могут рассматриваться  в качестве ключевых биомаркеров в антирадикальной и антиперекисной защите крови. Таким образом, уровень ферментных АО в крови крайне низкий и суммарно составляет менее 1% её антирадикальной и антиперекисной активности [20].

В результате многочисленных клинических исследований у пациентов с метаболическим синдромом были выявлены снижение активности антиоксидантных ферментов (СОД, ГПО), снижение общего антиоксидантного статуса плазмы крови, а также положительная взаимосвязь между уровнем перечисленных маркеров окислительного стресса и индексом массы тела [22,23,40].

В исследованиях по изучению ГЦК и ЦП было показано снижение активности ГПО путем определения его в цельной крови и плазме отдельно [21,22,23,35].

Соотношение GSH и GSSG является чувствительным маркером окислительного стресса. Когда клетки подвергаются повреждению, вызванному нитрозависимыми или окислительными свободными радикалами, молярное соотношение GSH: GSSG снижается от 100:1 до 1:1 [18,24,25].

В исследованиях итальянских ученых было продемонстрировано, что снижение уровня глутатиона в клетках увеличивает риск прогрессирования таких заболеваний, как НАЖБП, алкогольной болезни печени, хронических вирусных гепатитов [26,29]. Было доказано, что нарушение антиоксидантной защиты играет важную роль в ОС, связанной с НАСГ, о чем свидетельствует снижение глутатиона и снижение активности СОД, ГПО, каталазы и активности ГТ в корреляции с тяжестью заболевания [27,28]. Активность ГПО была использована в качестве диагностического критерия при некоторых заболеваниях печени для определения внутриклеточного окислительного стресса [23,30].

Канкуртаран и другие измеряли уровень витамина Е в сыворотке крови при НАЖБП (33,34). Авторы обнаружили корреляцию между низким уровнем витамина Е, высоким уровнем триглицеридов (ТГ), а также результатами сонографического исследования. Снижение уровня витамина Е и повышение уровня ТГ являются негативными прогностическими факторами, вызывающими прогрессирование жировой печени до стеатогепатита [33].

Убихинон или CoQ10 является важным компонентом электронно-транспортной цепи в митохондриях; поэтому, соотношение убихинол (CoQ10H2)/убихинон является надежным маркером окислительного стресса. В исследованиях Ямамото у пациентов с вирусными гепатитами, ЦП различной этиологии и ГЦК было показано снижение соотношения убихинола и убихинона [34].

Есилова и др. наблюдали повышение уровня окислительных маркеров в сыворотке крови (например, малоновый диальдегид (МДА)) которое сопровождалось снижением активности антиоксидантов (коэнзим Q10, медь-цинковая форма, СОД, каталазы) у пациентов с НАЖБП [35]. При НАЖБП происходит истощение ядерного фактора эритроидного происхождения (Nrf2), транскрипционного регулятора антиоксидантных белков, что приводит к нарушению антиоксидантной функции. В свою очередь, этот эффект способствует фиброзу, воспалению и прогрессированию жировых накоплений в печени [36,39]. Таким образом, при НАЖБП активность ферментов антиоксидантной защиты снижалась, а активность фосфолипазы увеличивалась при стеатогепатите. При этом следует отметить, что свободные жирные кислоты способны ингибировать глутатионзависимые ферменты. Дефицит холина и метионина способствует угнетению фермента cтеаторил-коэнзим А-десатураза-1 (SСД-1), которая катализирует десатурацию пальмитиновой и стеариновой кислот, регулирует запасы ТГ в клетке и проявляет защитное действие на клетки печени. Низкая активность SСД-1 усугубляет тяжесть течения стеатогепатита. [37,38,39]

В целом, активность/концентрация этих антиоксидантов имеет тенденцию к снижению у пациентов с НАЖБП/НАСГ, за некоторыми исключениями. Эти вариации, по-видимому, зависят от биоматериала, взятого для исследования: например, активность/концентрация антиоксидантов, определенных в образцах печени пациентов, как правило, снижается во всех рассмотренных случаях.

Однако существуют различия в отношении других клеток и тканей, таких, как эритроциты, плазма и сыворотка, где уровни антиоксидантов имеют тенденцию к повышению в большинстве случаев НАЖБП и НАСГ. Динамика показателей антиоксидантов представлена в табл.2.

Таблица 2. Динамика антиоксидантов как показатель оксидативного стресса при НАЖБП

Заключение

Представленные в обзоре литературные данные убедительно свидетельствуют о важной роли определения ферментных и неферментных антиоксидантов  при разных стадиях НАЖБП. Однако отдельные механизмы окислительного стресса  в патогенезе НАЖБП нуждаются в уточнении. Тем не менее, результаты исследований, проведенных в последние годы, дают основание надеяться на появление новых методов лабораторной диагностики, которые позволяют диагностировать переход стадии стеатоза в стеатогепатит при НАЖБП. 

Анализ литературных данных показал, что антиоксиданты, представляющие интерес для клинической и доклинической оценки НАЖБП и НАСГ, включают каталазу, глутатионредуктазу (ГР), глутатионтрансферазу (ГТ), глутатионпероксидазу (ГПО), которые позволяют адекватно оценить уровень ОС в образцах печени. Практический интерес представляет исследование антиоксидантов в плазме и в эритроцитах. У пациентов с НАЖБП наблюдается снижение антиоксидантной способности гепатацитов. Клинически ферментативные (САТ, СОД, ГР) и неферментативные антиоксидантные системы (GSH, α-токоферол и убихинон) снижены в крови, сыворотке, плазме и печени.

У пациентов с НАСГ определяются более низкие уровни антиоксидантов в сыворотке крови по сравнению с группами сравнения, истощение антиоксидантов в результате перекисного окисления липидов делает печень более восприимчивой к окислительному повреждению.

Диагностические подходы все еще остаются предметом дискуссий из-за наличия разных форм морфологических изменений при НАЖБП. На данный момент, ни один отдельный маркер не является достаточным для диагностики стадий заболевания.  Применение панели, включающей различные типы биомаркеров оксидативного стресса и антиоксидантной системы, может быть более перспективным в плане диагностики.