Актуальность

Современная генетика имеет в своем арсенале целый ряд методов, которые позволяют ей развиваться, совершать новые открытия и расширять возможности для диагностики наследственной патологии. Многие методы в генетике используются совместно, некоторые принадлежат исключительно генетике, некоторые имеют широкой спектр применения. Понимание возможностей методов генетики является залогом успешной диагностики наследственных заболеваний.

Генеалогический метод

Генеалогический метод широко используется не только в генетике, но и в других медицинских специальностях. Его целью является выявление наследственного характера заболевания. Этот метод является одним из старейших методов генетики, однако, несмотря на его рутинность и некоторую субъективность, метод до сих пор является одним из основных при диагностике наследственных заболеваний [1]. Часто этот метод называют клинико-генеалогическим, подчеркивая его тесную связь с клиническими проявлениями заболевания [2].

Генеалогический метод – это метод составления родословной пациента для определения типа наследования, пенетрантности, интенсивности мутационного процесса, определения группы сцепления генов, принадлежности гена к определенной хромосоме, наличие взаимодействия генов и вероятности рождения у пробанда ребенка с изучаемым или альтернативным ему признаком [3]. С помощью генеалогического метода можно диагностировать заболевания с менделирующими признаками, наследуемыми по аутосомно-доминантному и аутосомно-рецессивному типу, сцепленные с полом (Х-доминантные, Х-рецессивные, Y-сцепленные или голандрические) [4], а также заболевания с митохондриальным типом наследования. Заболевания с неменделирующим типом наследования, такие как эпигенетические, мультифакториальные болезни (с полигенным типом наследования), заболевания микросателитных тандемных повторов, заболевания митохондрий с ядерным типом наследования, выявить с помощью генеалогического метода можно, но определить тип наследования, как правило, нельзя [4, 5].

Таблица 1

Признаки менделевских типов наследования [4]

Рисунок 1. Аутосомно-доминантный тип наследования

Рисунок 2. Аутосомно-рецессивный тип наследования

Рисунок 3. Х-сцепленный доминантный тип наследования

Рисунок 4. Х-сцепленный  рецессивный тип наследования

Рисунок 5. Сцепленный с Y- хромосомой тип наследования

Митохондриальное (цитоплазматическое) наследование относится к неменделирующим признакам и связано с передачей митохондриальной ДНК только от матери. Этот тип наследования можно выявить при генеалогическом анализе. При нем больная мать передает заболевание митохондрий всем своим детям, а у больного отца рождаются только здоровые дети [4]. Клинически митохондриальные болезни характеризуются разной интенсивностью проявлений и сроками манифестации заболевания, что связано с неполной пенетрантностью, переменной экспрессивностью и плейотропией признаков митохондриальных болезней, и объясняется  гомо и гетероплазмией митохондриальной ДНК (рис. 6) [4].  

Рисунок 6. Митохондриальный тип наследования

При составлении генеалогического дерева соблюдают следующие правила:

Ценность генеалогического метода не уменьшается с годами, несмотря на появление новых современных и точных методов диагностики. Он позволяет существенно сузить круг заболеваний для дифференциальной диагностики наследственной патологии [4, 5].

Клинический метод

Клинический метод основан на тщательном осмотре пациента, включает синдромологический подход и выявление малых и больших аномалий развития [1,2,3,6].

Синдромальный подход в генетике понимается в двух разных смыслах. Первый связан с известным каждому врачу понятием "синдром" как совокупность симптомов, объединенных общим патологическим процессом. Второй является, как правило, авторским описанием клинического проявления наследственного заболевания и указывает на нарушение в структуре генома. Оба подхода не противоречат друг другу, а скорее дополняют и используются совместно [1,2,3,6].

Первый подход позволяет установить характер патогенетических изменений в организме и помогает в диагностике (например: синдром аутистических проявлений, синдром гепатомегалии, синдром нарушения роста). Второй подход дает определение заболеванию и является диагнозом (синдром ломкой Х-хромосомы, синдром Слая, синдром Нунан) [1,2,3,6].

В данном контексте все наследственные заболевания имеют характерные синдромологические проявления, которые помогают заподозрить наследственный характер патологии, а также служат дифференциально-диагностическими критериями в структуре наследственных заболеваний[1,2].

Наследственная патология имеет характерные клинические проявления: семейный характер заболевания; хроническое, прогредиентное, рецидивирующее течение; специфические симптомы наследственных болезней; множественные патологические изменения органов и систем; плейотропное действие гена (множестенное действие гена); врождённый характер заболевания (понятия врожденное и наследственное заболевание не однозначны); «резистентность» к наиболее распространённым методам терапии. Эти признаки позволяют заподозрить наследственный характер заболевания и далее использовать синдромологическую диагностику. В клинической генетике часто выделяют такие синдромы как синдром костных дизморфий, нарушение роста, интеллектуальные нарушения, нарушения слуха и зрения, эндокринопатии, кардиомиопатии и др. [1,2].

Аномалии развития, как большие, так и малые, практически всегда (в 90-95% случаев) указывают на наследственный характер патологии и позволяют поставить диагноз. Идентификация больших аномалий развития фактически и определяет диагноз. Малые аномалии развития (МАР)  или в старой терминологии "стигмы дизэмбриогенеза" указывают, что при внутриутробном развитии имело место негативное влияние внешних или внутренних (генетических) факторов. В норме таких МАР может быть не более 5-7, но в большем количестве они указывают на значимое нарушение развитие организма и служат специфическими диагностическими признаками наследственной патологии[1,2,3].

Цитогенетический метод

Этот метод является основой такого раздела генетики, как цитогенетика, и изучает цитологические принципы наследственности и изменчивости, структуру и функции хромосом, позволяют выявить  геномные и хромосомные мутации. Термин цитогенетика введен в 1903 г. В.Саттоном [4].

Цитогенетический метод появился в генетике с развитием световой и электронной микроскопии и позволил оценить состояние хромосомного аппарата клетки. Хроматин в клетке находится в ядре в рыхлом состоянии и для того чтобы увидеть хромосомы нужно заставить клетку делится, тогда хромосомы в клетке перейдут в спирализованное состояние и их можно будет увидеть в микроскоп. Поэтому для оценки хромосом используют клетки, имеющие ядро и способные делится вне организма. Как правило, это лейкоциты или буккальный эпителий. Клетки помещают в термостат на 3 суток при температуре тела (37°С) и сначала добавляют фитогемагглютинин (ФГА) (он заставляет клетки делиться), а затем колхицин (он останавливает деление на стадии метафазы). Клетки, вступившие в стадию метафазы, окрашивают с помощью G-метода и фотографируют с помощью светового микроскопа. Дальше полученный набор хромосом, который является кариотипом, распределяют по внешнему виду на пары хромосом, используя так называемую Денверскую классификацию. Полученное таким образом изображение хромосом называется кариограмма (рис. 7), а применяемый цитогенетический метод называется кариотипирование [4].

Рисунок 7. Схема получения кариограммы [2]

Полученные с помощью этого метода хромосомы можно окрашивать не только с помощью G-метода, но и с помощью С-метода (Comparative Genome Hybridization). В этом случае становятся видны районы хромосом, имеющие разную степень спирализованности, и тогда хромосомы можно идентифицировать по этим районам, используя Парижскую систему классификации хромосом [4].

С помощью метода кариотипирования в основном диагностируют хромосомные болезни.

Еще один метод, который тоже относится к цитогенетическим методам – это определение тельца Барра. Дело в том, что, как сказано выше, генетический материал в ядре деспирализован (т.е. располагается рыхло). Но если ядро содержит две Х-хромосомы, то одна Х-хромосома будет находиться в рабочем, т.е. в деспирализованном состоянии, а вторая, в качестве запасной будет спирализованна. Эта спирализованная Х-хромосома видна при специальном окрашивании в виде тельца Барра (рис. 8) [7].

Рисунок 8. Тельце Барра [7]

По количеству телец Барра можно определить пол или обнаружить аномалии пола. Количество Х-хромосом в клетке будет определяться по формуле: количество телец Барра + 1. Этот метод используется в качестве экспресс-диагностики определения полового хроматина [7].

Молекулярно-цитогенетические методы

Включает два основных метода, основанных на процессе гибридизации нуклеиновых кислот: флюоресцентной гибридизации in situ (fluorescence in situ hybridization – FISH) и сравнительной геномной гибридизации (comparative genomic hybridization – CGH) [5].

Гибридизация in situ основана на взаимодействии заранее помеченной флюорохромами однонитиевой ДНК (ДНК-зонд) и исследуемого образца ДНК. В начале в образце материала от пациента необходимо получить однонитевые последовательности ДНК путем денатурации. Далее воссоединяют полученные образцы однонитевых ДНК с последовательностями нуклеиновых кислот ДНК-зонда. Этот процесс и называется гибридизацией и проходит  в препарате метафазных хромосом (в интерфазном ядре). В результате образуются двунитевые молекулы ДНК. Те молекулы ДНК, нуклеотидная последовательность которых смогла по принципу комплементарности присоединить ДНК-зонд, оказывается меченной, ее видно с помощью флюоресцентного микроскопа, и можно проанализировать ее  последовательности нуклеотидов. Ограничение (разрешающая способность) метода определяется минимальным размером последовательности хромосомной ДНК (количеством нуклеотидов), которую возможно зафиксировать любым методом детекции. С помощью этого метода можно "прочитать" нуклеотидный состав конкретной хромосомы или ее отдельного участка, определить количество отдельных хромосом в клетке и их перестройки [5].

Сравнительная геномная гибридизация (aCGH) основана на сравнении двух образцов генетического материала: исследуемого и контрольного. Контрольный образец имеет заведомо известные характеристики: принадлежит мужчине/женщине, является здоровым. Оба образца метятся зондами, наносятся на микрочип, имеющий последовательности однониточных нуклеотидов (охватывают длину всех хромосом). Проводится реакция гибридизации. По соответствию интенсивности сигналов судят о численности нуклеотидов в участке хромосомы, определяя нехватку или удвоение хромосомы. Метод применяют в пренатальной и постнатальной диагностике врожденных пороков развития, онкологической патологии, диагностике микроделеционных и микродупликационных изменений одномоментно во всем геноме [5].

Спектроскопический анализ хромосом (SKY) проводят с использованием набора специфических зондов с разными красителями. Каждая пара хромосом имеет свои уникальные спектральные характеристики. Используемые флюоресцентные красители, имеющие сродство к определенным участкам хромосом позволяют определить пару хромосом.  Анализ кариотипа значительно облегчается, потому что гомологичные хромосомы имеют один и тот же цвет, а аберрации становятся легкоразличимыми. Благодаря такому подходу удается точно описать множественные структурные перестройки хромосом, происходящие в опухолевых клетках [5].

Молекулярно-генетический метод

Молекулярно-генетические методы сегодня являются как более современными и сложными, но и более дорогостоящими. Отличие этих методов от молекулярно-цитогенетических состоит в том, что эти методы не зависят от спирализации хромосом на момент исследования. Одно из названий этих методов – ДНК-диагностика. К ним относятся: полимеразная цепная реакция (ПЦР), секвенирование, блот-гибридизация по Саузерну, гибридизационные биочипы, полногеномный анализ. Методы ДНК-диагностики позволяют выявить мутации непосредственно в гене [4, 5].

В основе ПЦР лежит многократное увеличение малых концентраций фрагментов ДНК с помощью амплификатора. Используется специфический праймер (искусственно созданная последовательность нуклеотидов, комплементарная определенному участку исходной ДНК), позволяющий идентифицировать искомую последовательность нуклеотидов. Преимущества метода заключается в возможности анализа малого количества биологического материала [4, 5].

Секвенирование – метод, позволяющий исследовать последовательность нуклеотидов в ДНК, как белок-кодирующие участки (секвенирование экзома), так и всю последовательность, включая некодирующие «молчащие» области генома (полногеномное секвенирование генома) [5].

Существуют два основных метода секвенирования ДНК: химический и ферментативный. Химический метод (по Максаму-Гилберту) заключается в расщеплении меченых участков ДНК с помощью химических веществ (химическая деградация). Метод разработан Алланом Максамом и Уолтером Гилбертом в 1976 году. Концентрация и длительность воздействия реагента подбираются таким образом, что происходит модификация нуклеотидов только одного типа (например: только цитозина). Далее происходит разделение по меченым участкам с помощью электрофореза в агарозном геле [5].

Ферментативный метод заключается в синтезе участка изучаемой цепи ДНК с помощью остановки синтеза на заданном основании путем присоединения дидезоксинуклеотида и реакция происходит в несколько этапов: гибридизация участка ДНК с праймером, ферментативный синтез ДНК, денатурация с образованием однониточных нуклеотидных последовательностей разной длины (содержащие праймер), электрофорез в полиакриламидном геле. Метод был разработан Фредериком Сэнгером в 1977 году [5].

Сегодня развиваются методы секвенирования ДНК нового поколения (next generation sequencing – NGS), основанные на секвенировании ДНК-чипов во время интерактивных циклических ферментативных реакций, позволяющие одновременно читать несколько участков ДНК [5].

Популяционный метод

Этот метод, который изучает распространенность наследственных заболеваний или признаков в популяциях. Развитие популяций характеризуются условиями, в которых они существуют. По характеру изолированности популяции могут разделяться на панмиктические (население крупного города), демы (относительно небольшая группа людей, живущих на ограниченной территории и составляющих браки между собой), изоляты (небольшие, генетически изолированные популяции внутри которых совершаются браки). Типы популяций отличаются друг от друга численностью, частотой внутригрупповых браков, долей иммигрантов, приростом населения, в них может прослеживаться также эффект основателя. Популяция характеризуется следующими показатели: генофонд (совокупность генотипов всех членов популяции), частоты генов, частота генотипов, частота фенотипов, система браков, изменяющие частоты генов факторы [2].

Для изучения частот встречаемости определенных генов и генотипов, в том числе наследственной патологии используется закон Харди-Вайнберга. Закон Харди-Вайнберга постулирует, что при свободном скрещивании, отсутствии миграции особей и отсутствии мутаций относительная частота индивидуумов с каждым из аллелей генов будет оставаться в популяции постоянной из поколения в поколение. Закон Харди-Вайнберга в 1908 году независимо друг от друга открыли Харди и Вайберг, высчитав математическую модель сохранения генетического равновесия в популяции. Было сформулировано, что "Частота генотипов по определенному гену в популяции остается постоянной в ряду поколений и соответствует уравнению p2 + 2pq + q2 = 1"  [2], где

p2 – частота как доля от единицы гомозигот по одному аллелю (например, доминантному – AA),

q2– частота гомозигот по другому аллелю (aa),

2pq – частота гетерозигот (Aa),

p – частота в популяции первого аллеля (A),

q – частота второго аллеля (a).

При этом p + q = 1, или A + a = 1.

Благодаря этому закону мы достаточно точно можем определить частоту встречаемости определенной патологии в исследуемой популяции. Это помогает значительно сузить дифференциально диагностические ряды наследственной патологии в зависимости от принадлежности пациента к определенной популяции (например в популяции, выделенной по национальному признаку). При этом всегда надо помнить о том, что изменение равновесия генотипов и аллелей в популяциях происходит постоянно под влиянием мутационного процесса, популяционных волн, изоляций, естественного отбора, дрейфа генов, эмиграции и иммиграции, а также инбридинга. Этот процесс является частью эволюции [2].

Близнецовый метод

Один из самых старых методов в генетике. Близнецовый метод был предложен Фрэнсисом Гальтоном. Выделение среди близнецов однояйцовых (монозиготных) и двуяйцовых (дизиготных) дали возможность оценить степень влияния наследственности и среды на развитие какого-либо признака, а также изучить явления конкордантности (сходства по изучаемому признаку, выраженного в процентах) и дискордантности (отсутствия признака у одного из близнецов) [2].

Было показано, что наследуемость  признака можно оценить по формуле:

Н = (% сходства ОБ – % сходства ДБ) / (100 – % сходства ДБ)

где:

Н – коэффицент наследственности

ОБ – однояйцевые близнецы

ДБ – двуяйцевые близнецы

Таким образом, если Н = 1, то признак полностью определяется наследственным компонентом, если Н = 0, то признак определяется только влиянием среды, при Н = близкий к 0,5 признак определяется примерно одинаковым влиянием наследственности и среды на формирование признака  [2].

Благодаря этому методу появилась возможность разделить всю наследственную патологию на группы заболеваний: наследственные болезни (наследуемость 1-0,7 %: фенилкетонурия, гомоцистинурия), мультифакториальные (наследуемость 0,4-0,6 %: артериальная гипертензия, шизофрения), зависящие от среды (наследуемость 0-0,3 %: инфекционные, профессиональные заболевания).

Благодаря этому методу была изучена пенетрантность аллелей генов и экспрессивность  [2].

Дерматоглифический метод

Дерматоглифика начала развиваться в 17-18 веках вместе с работами Марчело Мальпиги, описавшим микроскопическое строение кожи и Яна Эвангелиста Пуркине, опубликовавшего свою работу, посвящённую отпечаткам пальцев. Как метод генетики дерматоглифика была предложена в 1961 году Камингс и Мидло. А в 1982 году Фрэнсис Гальтон предложил классификацию узорных типов, позволившую использовать этот метод для идентификации личности в криминалистике, судебной медицине, при определении зиготности близнецов и в антропологи  [2, 3].

Метод основан на изучении кожного рисунка на пальцах, ладонях и стопах. В отличие от других частей тела эти поверхности имеют эпидермальные выступы (гребни), образующие сложные узоры, которые не повторяются ни у одного человека. Метод предполагает анализ рисунка и поиск соответствий наследственным заболеваниям. В настоящий момент диагностические критерии разработаны для таких заболеваний, как: синдромы Шерешевского-Тернера, Клайнфельтера, Дауна, синдром Рубинштейна-Тейби и де Ланге и др.  [2].

Одним из вариантов этого метода является дактилоскопия, широко используемая в криминалистике [2].

Биоинформационный метод

Данный метод позволяет создать алгоритмы расшифровки и анализа полученных последовательностей нуклеотидных оснований, полученных с помощью других методов, в том числе секвенирования. При секвенировании генома получают последовательность нуклеотидов в исследуемом отрезке ДНК. Для того чтобы понять каким генам он соответствует нужно сравнить последовательность в исследуемом образце с уже известными последовательностями в геноме. Для этого разрабатывается программное обеспечение, позволяющее провести это сравнение автоматически  [1].

Биохимические методы

Большинство форм наследственной патологии изменяет биохимию организма. Поэтому практически все известные в широкой практике биохимические методы используются и в генетике. Однако, некоторые наследственные нарушения связаны с появлением специфических изменений в метаболизме. Биохимическими маркерами наследственной патологии могут служить ферменты (активность которых изменяется по сравнению с контролем), первичные и вторичные метаболиты. В генетике принято оценивать биохимический фенотип на уровне метаболитов. Для этих целей применяют различные виды хроматографии, часто в сочетании с масс-спектрометрическим анализом. Это позволяет оценить множество соединений в одном образце. К этим методам относятся: высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), газовая хроматография (ГХ), тандемная масс-спектрометрия (MS/MS). Используя метаболический подход можно диагностировать наследственные нарушения обмена по изменению концентрации метаболита [1].

Параклинические методы

Данная группа методов основана на диагностике различных клинических проявлений, поэтому включает биохимические, иммунологические, гематологические, эндокринологические, электрофизиологические, рентгенологические и другие методы. К параклиническим методам также относится ряд проб, предложенных для ориентировочной диагностики, например: проба Феллинга для диагностики фенилкетонурии на основе реакции мочи с хлоридом железа [1].

Биоинженерные методы

Данные методы применяются в качестве разработки новых методов лечения, т.е. получения генотерапевтических препаратов. Генная инженерия сегодня решает задачи получения генов искусственным путем, выделения их из клеток, синтез рекомбинантных молекул ДНК, клонирования генов или генетических структур и многие другие [1]. Генотерапия может быть использована для лечения как моногенных, так и мультифакториальных (в том числе онкологических) заболеваний человека. По своей сути именно генотерапия является этиологическим методом лечения наследственной патологии. Все остальные методы лечения как правило являются либо симптоматическими, либо патогенетическими методами терапии. Генотерапия подразумевает  доставку нужного гена в клетки-мишени. Основной практической проблемой генотерапии является проблема переноса генов. Сегодня это решается различными методами, в том числе прямая инъекция в ткань "голого" гена, кальций - фосфатная трансфекция, перенос с помощью липосом, электропорация, перенос генов с помощью ретро вирусов или вирусных векторов, прицельная доставка генов в определенный тип клеток с использованием рецепторов этих клеток и некоторые другие методы.  Методы различаются по эффективности доставки генетических конструкций в клетки-реципиенты и этим определяется эффективность методов генотерапии. Сегодня генотерапевтическими методами возможно лечить муковисцедоз, наследственные иммунодефициты, наследственные болезни обмена и др. [1].

Методы моделирования

Эти методы используются в доклинических испытаниях лекарственных средств на лабораторных животных, либо культурах клеток, имеющих заданный генетический признак. Такие признаки получают геноинженерным путем, и это позволяет создать клиническую модель реакции генов на воздействие лекарственного препарата [1, 2, 3]. В 1987 г. М. Хупер и М. Куэн с соавторами разработали метод избирательной инактивации генов в организме животных, что позволило разработать один из методов создания моделей наследственных заболеваний. Примером может служить болезнь Леша-Нихана. При этом заболевании нарушается работа гена, отвечающего за гипоксантин-гуанозин-фосфорибозилтрансферазу (ГГФРТ). Инактивируя гены мышей по гену ГГФРТ, получали клиническую картину болезни Леша-Нихана. Это позволило разработать патогенетическую терапию для этого заболевания.

Конструирование генетических моделей животных позволяет понять работу генов и их мутантных вариантов, составить более полное представление о интерактоме, метаболоме и их взаимодействии.

Заключение

Методологическая основа генетики расширяется с каждым годом. Появление новых ультрасовременных методов не  вытесняет использование рутинных и старых методов (например, таких как генеалогический метод). Часто методы используются одновременно, либо применяют последовательно в диагностических схемах. Как правило, вначале применяют методы, позволяющие отсечь целые группы и классы заболеваний и имеющие наименьшую стоимость в клинической практике, а затем прибегают к более точным, современным, но и более дорогостоящим методикам. Такой подход позволяет установить диагноз даже самого редкого наследственного заболевания.

В рамках организации работы медико-генетической службы на первом этапе диагностики наследственной патологии используются скрининговые методы диагностики, а затем более сложные и дорогостоящие (цитогенетические, молекулярно-генетические и др.).