Актуальность

Всю жизнь организм человека сталкивается с большим количеством чужеродных соединений, которые называются ксенобиотики (лекарственные препараты, средства бытовой химии и продукты хозяйственной деятельности). В процессе эволюции возникли ферментативные системы биотрансформации (детоксикации) таких веществ, одной из которых является группа ферментов конъюгации. Существенную роль в ней играет N-ацетилтрансфераза (NAT) [1]. Это фермент второй фазы детоксикации, которая осуществляет N-ацетилирование (дезактивацию) ароматических и O-ацетилирование (активацию) гетероциклических аминов, к которым относятся многие канцерогены и некоторые лекарственные препараты [2].

У человека определены два изофермента N-ацетилтрансферазы (NAT1 и NAT2). Основным ферментом ацетилирования ряда лекарственных препаратов, содержащих аминогруппу является NAT2 [3]. Ген NAT2 – полиморфный, содержит 97 аллелей и поразительное множество нуклеотидных вариаций [4]. Различное сочетание этих вариантов (генотип) влияет на структуру фермента (фенотип) и его способность к ацетилированию [5].

Установлены различные вариации аллелей, гаплотипов и фенотипов NAT2 в разных популяциях и этнических группах, показывая влияние демографических событий, исторических и культурных взаимодействий на генетическую изменчивость [6]. Кроме того, показано – образ жизни человека и фенотип NAT2 связаны с восприимчивостью к неоплазии, резистентностью к инсулину и метаболическим изменениям [7,8]. Обсуждались вопросы, связанные со скоростью процессов ацетилирования NAT2 при таких заболеваниях, как туберкулез [9], язвенный колит [10], болезнь Альцгеймера [11], различных онкологических заболеваниях, в том числе и раке щитовидной железы [12,13,14,15,16,17,18,19,20].

До настоящего времени нет данных о роли NAT2 в развитии осложнений доброкачественных заболеваний щитовидной железы, в том числе у пациентов с тиреотоксикозом. Выявление ассоциаций между наиболее часто встречающимися однонуклеотидными полиморфизмами в структурной области гена NAT2 (С282Т, Т341С, С482Т, А803G, G857A, G590A) и особенностями течения доброкачественных заболеваний щитовидной железы позволит дополнить современные представления о патогенезе диффузного и многоузлового зоба.

Цель исследования 

Изучить особенности полиморфизма гена у больных, оперированных по поводу эутиреоидного и токсического зоба, и его роль в развитии осложнений заболевания и операции.

Материалы и методы

Клиническое исследование проведено с 2021 по 2023 г. на базе отделения торакальной хирургии Иркутской ордена «Знак почета» областной клинической больницы (ИОКБ). Исследование полиморфизма гена NAT2 проведено с 2021 по 2023 г. на базе лаборатории клеточной патофизиологии и биохимии Иркутского научного центра хирургии и травматологии.

В одноцентровое наблюдательное проспективное исследование с ретроспективным сбором данных включены пациенты европеоидной расы, проживающие на территории Иркутской области, которые в течение 2021–2023 гг. прооперированы в объеме тиреоидэктомии по поводу многоузлового эутиреоидного зоба с развитием компрессионного синдрома шеи, многоузлового токсического зоба с декомпенсированной функциональной автономией железы и диффузного токсического зоба в случаях непереносимости тиреостатической терапии, рецидиве тиреотоксикоза при отказе от лечения радиоактивным иодом.

Критерии включения: рецидив тиреотоксикоза; непереносимость тиреостатической терапии; наличие декомпенсированной функциональной автономии щитовидной железы сдавление органов шеи увеличенной щитовидной железой.

Критерии исключения: отказ больного от исследования; возраст младше 18 лет и старше 80 лет; односторонняя операция на щитовидной железе; наличие смежной патологии околощитовидных желез, требующих хирургической коррекции; злокачественные новообразования щитовидной железы.

В соответствии с критериями в исследование включены 31 пациент с доброкачественными заболеваниями щитовидной железы (28 женщин и трое мужчин). Медиана возраста составила 60 (49-64) лет.

В ходе исследования больные ранжированы на три группы в зависимости от установленного диагноза: 1 - диффузный токсический зоб (ДТЗ) (n=11), 2 – многоузловой токсический зоб (МУТЗ) (n=12) и 3 - многоузловой зоб без тиреотоксикоза (МУЗ) (n=18).

Осложнение заболевания в виде тиреотоксического сердца (фибрилляция предсердий) выявлено у девяти пациентов; сдавление органов шеи (трахеи и пищевода) – у 22. Эндокринная офтальмопатия (по шкале CAS (clinical activity score)<3) установлена у девяти пациентов. Непереносимость тиреостатической терапии, проявляющаяся в развитии нейтропении (снижение уровня нейтрофилов ниже 1500 в 1 мкл периферической крови), отмечена у двух больных.

Группу контроля составили добровольцы европеоидной расы (четыре женщины и один мужчина), проживающие на территории Иркутской области без патологии щитовидной железы в возрасте 48 (37-61) лет.

Всем больным выполнено стандартное для тиреоидной патологии клинико-лабораторное и инструментальное обследование (общий и биохимический анализ крови, мочи, основные показатели гемостаза, ультразвуковое исследование щитовидной железы, рентгенологическое обследование для выявления сдавления органов шеи, оценка гормональной активности по уровню кальцитонина крови,  тиреоторопного гормона гипофиза (ТТГ) и свободного тироксина, антител к рецепторам ТТГ и сцинтиграфии щитовидной железы с технецием-пертехнетатом при тиреотоксикозе).  Изучали анамнестические данные и результаты объективного осмотра. Хирургические вмешательства выполнялись хирургами отделения торакальной хирургии ИОКБ с соблюдением принципа визуального контроля сохранности возвратных гортанных нервов и околощитовидных желез, дренирования зоны операции. Оценивали течение послеоперационного периода до выписки больного из стационара с обязательным проведением исследования подвижности голосовых складок (ларингоскопия) и уровня кальция крови. Все полученные данные вносили в статистические таблицы.

Для исследования полиморфизмов гена NAT2 использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени.

Кровь забирали из локтевой вены. Геномную дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) выделяли из лейкоцитов крови набором реагентов «Номотек - Экстракт ДНК -2» (ООО «Номотек», Ref R1003, Россия). Метод основан на лизисе клеток с последующей очисткой ДНК на микроцентрифужных колонках.

Вначале производилось разрушение клеток, инактивация клеточных нуклеаз и депротеинизация. В дальнейшем в присутствии хаотропных веществ ДНК сорбировали на мембране микроцентрифужной колонки с последующей отмывкой для удаления ингибирующих ПЦР примесей, после чего производили элюирование ДНК с мембраны. Для контроля контаминации во время каждого выделения ДНК использовали отрицательный контроль выделения. Полученный препарат геномной ДНК использовали для выявления полиморфизмов гена NAT2 с помощью набора реагентов «ГенТест-М NAT2» (ООО «Номотек», кат. R2006, Россия). Последний содержит все необходимые праймеры и реакционные смеси для проведения специфической ПЦР, что позволяет определить шесть аллелей полиморфизма NAT2: С282Т (rs1041983), T341C (rs1801280), С481Т (rs1799929), G590A (rs1799930), А803G (rs1208) и G857A (rs1799931). В каждой постановке использовали отрицательные контроли выделения, а также для контроля прохождения ПЦР и верного определения генотипов ставили положительные контрольные образцы («дикая» гомозигота, гетерозигота, мутантная гомозигота), содержащие смесь синтетических матриц ДНК, содержащих последовательности генотипов искомых полиморфизмов.

ПЦР включала в себя две стадии. На первой стадии анализа ДНК производили амплификацию целевого фрагмента ДНК с участием специфических праймеров, причем амплификация проходила вне зависимости от аллельного варианта. На второй стадии анализа ДНК происходило определение генотипа путем температурного плавления дуплекса: детектирующий зонд – ампликон. Поскольку температура плавления дуплекса, образованного зондом и «аллелем 1» отличалась от температуры плавления дуплекса, образованного зондом и «аллелем 2», то ДНК, содержащая оба аллеля, имела две температуры плавления, что визуализировалось и регистрировалось при анализе.

В соответствии с декларацией производителя, в нашем эксперименте в исследуемых образцах не было выявлено предельных концентраций веществ, которые могли бы повлиять на результат исследования. Препараты ДНК хранили при температуре от -28 до -10°С с соблюдением мер, предотвращающих контаминацию образцов чужеродной ДНК до момента постановки ПЦР. Полученные при выделении ДНК отрицательные контрольные образцы, прошедшие все стадии процедуры, включали вместе с исследуемыми образцами, выделенными одновременно с ними. Каждую реакцию с контрольными и исследуемыми образцами выполняли в двухкратно.

Параметр «Пороговый уровень» (Treshold) для программируемого амплификатора CFX96 (Bio Rad, USA), используемого для измерений, вводили в значении 50. При необходимости изменяли значения Baseline так, чтобы часть графика флуоресценции до начала экспоненциального роста сигнала становилась параллельной оси абсцисс и близка к нулю по оси ординат. Анализ валидировали, если выполнялось условие Cq£30, то есть в исследуемом образце концентрация ДНК была однозначно больше предела обнаружения (1 нг/мкл) и форма пиков и их температуры плавления соответствовали заявленным параметрам в рекомендациях производителя набора реагентов.

Этическая экспертиза. Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании.

Статистический анализ проводили с помощью пакета программ Statistica 10.0 for Windows (лицензия №AXAR402G263414FA-V). Выполнялся описательный и сравнительный анализ с использованием методов непараметрической статистики. Непрерывные данные представляли в виде медианы с нижним и верхним квартилями, категориальные - в виде числа наблюдений и частоты в процентах. Определение статистической значимости различий для категориальных данных (р) проведено по критериям Пирсона (χ2), точного критерия Фишера. Корреляционный анализ выявленных статистически значимых параметров проведен на основе ранговых корреляций Спирмена. Анализ на соответствие частот равновесию Харди-Вайнберга проводили с помощью калькулятора https://www.sebc.me/bioblog/labs/hwe-calculator

Результаты

В ходе исследования выявлены все шесть исследуемых аллелей полиморфизмов гена NAT2 с различной частотой встречаемости. Распределение наблюдаемых частот генотипов в контрольной группе соответствует   равновесию Харди-Вайнберга. Наименьшей частотой отличалась аллель G857A NAT2, встречалась только в гетерозиготном состоянии и не обнаружена в виде мутантной гомозиготы как в контроле, так и в обследуемых группах пациентов (таблица 1). Можно предполагать, что присутствие этой аллели не характерно для рассматриваемой когорты обследуемых.

Таблица 1. Число образцов с выявленными однонуклеотидными полиморфизмами гена NAT2

Table 1. Number of samples with detected single nucleotide polymorphisms of the NAT2 gene

Примечание: 1 – «дикий» тип (нет замен нуклеотидов в данном локусе); 2 –гетерозигота; 3 – аналогичная замена в обеих гомологичных хромосомах (полный мутант), p – уровень значимости различий равновесия Харди-Вайнберга, χ2 – значение кси-квадрат равновесия Харди-Вайнберга.

На следующем этапе исследования произведен последовательный сравнительный анализ частот (по критерию Хи-квадрат) выявления однонуклеотидных замен в структурной области гена NAT2 (в одном или двух аллелях).

Согласно таблице 1, в контрольной группе не выявлялось полиморфизмов С282Т и G857A гена NAT2. Частота выявления отсутствия нуклеотидных замен в С282Т нуклеотидной цепи гена NAT2 различалась в группах от 45 до 62% (таблица 2).

Таблица 2. Различие частот в выявлении «дикого» типа С282T NAT2 в зависимости от патологии щитовидной железы

Table 2. Differences in the frequencies of detection of the wild type C282T NAT2 depending on thyroid pathology

Как представлено в таблице 2, при токсических формах зоба частота выявления неизменных последовательностей (гомозиготы по «дикому» типу) в C282T снижена до 45-50 %, различия статистически значимы в сравнении с группой контроля (p<0,05).

При сравнении частот выявления изменения последовательностей нуклеотидов (в обеих гомологичных хромосомах) (гомозигота-мутант) получено значимое преобладание нуклеотидной замены в группе МУТЗ по полиморфизму Т341С NAT2 (таблица 3).

Таблица 3. Различие частот выявления полиморфизма Т341С гена NAT2 в гомозиготном состоянии в зависимости от патологии щитовидной железы

Table 3. Differences in the frequencies of detection of the T341C polymorphism of the NAT2 gene in the homozygous state depending on the pathology of the thyroid gland

Частота выявления полиморфизма Т341С гена NAT2 в гомозиготном состоянии при многоузловом токсическом зобе составила 33 % и не выявлялась при диффузном токсическом зобе и в контроле. Различия частот статистически значимы (p<0,05).

При исследовании зависимости частоты развития нейтропении и полиморфного состояния гена NAT2 установлено отсутствие влияния однонуклеотидной замены С282Т NAT2 на уменьшение числа нейтрофилов в периферической крови. При отсутствии замены С282Т в гене NAT2, нейтропения развилась у 1 из 11 больных (9 %), а при выявлении мутаций – у 1 из 12 (8 %) (критерий Хи-квадрат; p=0,95).

Частота развития тиреотоксического сердца в зависимости от выявленных полиморфизмов NAT2 составила 0-25 %, т.е. различия не значимы (p>0,5). Анализ сопряженности полиморфизмов NAT2 представлен в таблице 4.

Таблица 4. Сопряженность полиморфизмов NAT2

Table 4. Conjugacy of NAT2 polymorphisms

Примечание: «-» - показатель статистически не значим. R- корреляция Спирмена, n-число наблюдений, p – уровень значимости коэффициента корреляции.

При анализе согласованности мутаций в полиморфизмах гена NAT2 установлена статистически значимая зависимость между частотой выявления дикого и мутантного типа по всем полиморфизмам, кроме G857А. При ДТЗ отмечалась умеренная отрицательная корреляция между C282T, C481T, Т341С и G590A. При МУТЗ связь между C282T, G590A, A803G, C481T была положительной 

Таким образом, полиморфизм С282Т гена NAT2 может быть связан с рецидивным течением тиреотоксикоза при диффузном и многоузловом зобе, но не ассоциирован с нейтропенией, развившейся вследствие тиреостатической терапии. Для развития функциональной автономии при многоузловом зобе характерно увеличение частоты выявления полиморфизма Т341С NAT2 в гомозиготном состоянии (с заменой в обоих аллелях).

Обсуждение

Исследование впервые оценивает полиморфизм гена NAT2 в образках крови у пациентов Иркутской области с эутиреоидным и токсическим зобом, а также показывает его зависимость от клинического варианта и осложнений заболевания.

         В таблице 5 представлена характеристика изученных у наших пациентов однонуклеотидных полиморфизмов гена NAT2 и их распространенность в мире [21].

Таблица 5. Характеристика изученных однонуклеотидных полиморфизмов гена NAT2 и их распространенность в мире

Table 5. Characteristics of the studied single nucleotide polymorphisms of NAT2 gene and their prevalence in the world

Выбранные нами для исследования нуклеотидные последовательности (rs1041983 rs1801280, rs1799929, rs1799930, rs1208 и rs1799931) являются наиболее изученными и представлены по всему миру. Большинство из них формируют медленный фенотип ацетилирования, который характерен для жителей Европы, Ближневого востока и Африки, в то время как дикие типы rs1799929 и rs1208 – быстрый, встречающиеся у жителей Азии и Америки [6]. Для жителей России, как и для европейской популяции характерно преобладание медленного фенотипа ацетилирования [22].

В ходе работы установлено, что присутствие полиморфизма G857A NAT2 в виде мутантной гомозиготы не характерно для рассматриваемой когорты жителей региона.

При токсических формах зоба частота выявления неизменной последовательности нуклеотидов в гомозиготном состоянии в позиции C282T гена NAT2 снижена (до 45 % при ДТЗ и до 50 % при МУТЗ), в сравнении с группой контроля (p <0,0005).

Частота выявления полиморфизма Т341С NAT2 в гомозиготном состоянии (оба аллеля на гомогологичных хромосомах содержали мутацию) при многоузловом токсическом зобе составила 33 % и не выявлялась при диффузном токсическом зобе и в контроле (p <0,0005).

Частота развития нейтропении на фоне приема тиамазола составила 9 % и не зависела от полиморфизма С282Т гена NAT2 (p>0,95).

Установлена статистически значимая сопряженность между частотой выявления дикого и мутантного типа по всем исследованным нуклеотидным цепям гена NAT2, кроме G857A.

При диффузном токсическом зобе отмечалась умеренная отрицательная корреляция между C282T и C481T, Т341С (p <0,0005). В тоже время при многоузловом токсическом зобе выявлена положительная связь между C282T и G590A (p <0,0005).

При проведении генетических исследований наиболее значимый проектом, на который ссылаются большинство молекулярных биологов при сопоставлении своих результатов с уже имеющейся информацией является работа, в результате которой была предложена Интегративная карта экспрессии генов и Атлас белков человека, где также приводятся и данные о экспрессии мРНК и белков примерно 80 % известных белок-кодирующих генов человека [23]. В этом основополагающем масштабном проекте проведена работа по классификации тканеспецифичной экспрессии генов основных органов и тканей человека с использованием методов транскриптомики (секвенирование РНК) и протеомики. Транскриптом 27 различных органов и тканей человека был проанализирован с помощью секвенирования нового поколения на основе образцов, взятых у 95 человек. В этом проекте было проанализировано также 4 образца ткани щитовидной железы. Активность гена NAT1 находилась на низком уровне, а ген NAT2 не был исследован.

Учитывая полное отсутствие работ по оценке полиморфизма гена NAT2 у пациентов с доброкачественными заболеваниями щитовидной железы, провести сравнение с другими опубликованными данными проблематично. Однако существуют работы, в которых изучалась ассоциация полиморфизма гена NAT2 с развитием рака щитовидной железы.

Так, Guilhen A. C. с соавт.  показали, что присутствие у пациента нуклеотидной последовательности A803G (rs1208) и отсутствие C282T (rs1041983) и G191A (rs1801279) повышало риск развития папиллярного рака щитовидной железы в 1,8, 6,6 и 4,6 раз соответственно [24]. Barbieri R.B. с соавт. в нескольких исследованиях показывают, что присутствие нуклеотидных полиморфизмов генов NAT2, ассоциированный с медленным фенотипом ацетилирования, повышают риск развития медуллярного рака щитовидной железы [25,26].

Исследование имело ряд ограничений: небольшой размер выборки пациентов и лиц контрольной группы; все исследуемые были жители одного региона.

Заключение

При токсических формах зоба наблюдалось снижение частоты выявление однонуклеотидной последовательности C282T гена NAT2 в гомозиготном состоянии (до 45 % при диффузном токсическом до 50 % при многоузловом токсическом) и отсутствие  Т341С NAT2 в гомозиготном состоянии состоянии (при диффузном токсическом). Полиморфизм однонуклеотидной последовательности G857A NAT2 в виде мутантной гомозиготы не характерен для жителей региона с рассматриваемой доброкачественной патологией щитовидной железы. Тем не менее, наши результаты нуждаются в дальнейшей проверке в будущих исследованиях с большим размером выборки и более разнообразными этническими группами.